清华大学于慧敏课题组建立基于CRISPR/Cas9系统的浑浊红球菌基因编辑方法|SSB

浑浊红球菌（Rhodococcus opacus PD630）是一种重要的产油脂放线菌，也被视为木质素生物转化的理想底盘。木质素降解物中含有大量芳香族化合物，会抑制细菌的生长而影响木质素的利用效率；浑浊红球菌含有丰富的代谢酶系，可降解、利用芳香族化合物，因此在木质素利用中具有独特的优势。此外，在氮源限制的条件下，浑浊红球菌可以大量积累三酰甘油（可达到细胞干重的78%以上），因此也被广泛用于生物油脂的合成。
然而，浑浊红球菌是一种较为少见的非模式微生物，基因组GC含量约为67%，总体而言，其基因操作元件相对匮乏，基因改造难度大。目前，其基因敲除等编辑操作仍主要依赖于常规的同源重组，不仅效率较低，还经常出现严重的非法重组问题，导致其重组改造研究进展缓慢。CRISPR/Cas9是目前最热门的基因编辑技术之一，具有无痕、高效的特点，已广泛用于多种动植物和微生物中，但其在浑浊红球菌中的应用还从未实现。
近日，清华大学于慧敏课题组在Synthetic and Systems Biotechnology发表文章，建立了一种基于CRISPR/Cas9的ssDNA重组系统，成功实现浑浊红球菌的无痕基因编辑改造。

该工作是于慧敏课题组在前期成功建立红色红球菌（Rhodococcus ruber）基于CRISPR/Cas9的dsDNA基因编辑方法（Metabolic Engineering, 2020, 57: 13-22）并系统总结红球菌基因改造工具体系（Biotechnology Advances, 2021, 49: 107748）之后的又一突破。该工作发现，Cas9蛋白的细胞毒性和宿主菌对DNA双链断裂的低修复效率是导致常规CRISPR/Cas9系统无法应用于浑浊红球菌的关键瓶颈。对此，该工作一方面通过启动子优化，降低Cas9表达量以减小细胞毒性，实现了Cas9-sgRNA复合体对DNA的切割作用；另一方面通过红球菌前噬菌体重组酶的挖掘和筛选，得到新型重组酶RrRecT，可促进ssDNA（40~80 nt）的高效重组；最终将新重组酶RrRecT引入CRISPR/Cas9系统中，成功建立了基于CRISPR/Cas9反向筛选的ssDNA重组系统，实现了浑浊红球菌的基因敲除和点突变改造，效率为100%~22%。该工作拓展了浑浊红球菌的基因操作工具箱，为其代谢工程改造提供了新方法，也为其它难改造非模式微生物的基因编辑方法建立提供了借鉴。

Schematic diagram of a CRISPR/Cas9-based ssDNA recombineering system for genome editing in Rhodococcus opacus PD630

文章信息

A CRISPR/Cas9-based single-stranded DNA recombineering system for genome editing of Rhodococcus opacus PD630

Youxiang Liang, Yuwen Wei, Song Jiao, Huimin Yu

Volume 6, Issue 3, September 2021, Pages 200-208

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关于作者

通讯作者于慧敏，清华大学化工系、工业生物催化教育部重点实验室长聘教授，博士生导师。入选教育部新世纪优秀人才、全国百篇优博论文作者、北京市科技新星（A类）。主要从事先进生物制造及纳米生物技术研究，致力于面向工业环境发展高性能生物催化剂构建技术与理论。主持国家重点研发、973、863、国家自然科学基金、全国百篇优博论文专项等课题30余项，在Biotechnology Advances, Metabolic Engineering，ACS Synthetic Biology等学术期刊上发表论文130余篇，出版专著章节5部，申请/授权发明专利40余项。产业化项目已创利税8亿多元。曾获教育部技术发明二等奖、自然科学二等奖、中石化工联合会技术发明二等奖、青年科技突出贡献奖等。现任中国生化制药工业协会糖类药物分会专家委员；Biotechnology Notes 副主编，Biochemical Engineering Journal、《化学与生物工程》编委。亚洲合成生物学联盟成员，欧洲生物技术协会成员，Metabolic Engineering Summit 14主席团成员。

关于期刊

Synthetic and Systems Biotechnology 是由科爱出版的高质量国际开放获取期刊，创刊于2016年。该期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。

• 本刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus等数据库收录。
• 2021年获得第一个影响因子：4.708，Q1区
• 2020CiteScore: 8.4，学科领域排名14/113。
• 本刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目。
• 本刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊。
• 本刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊。

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